蛋白酶K在DNA提取中主要發(fā)揮降解蛋白質(zhì)的作用,能有效去除組蛋白、核酸酶等干擾物質(zhì),提高DNA純度和得率。其核心功能包括裂解細(xì)胞結(jié)構(gòu)、滅活核酸酶、解除DNA-蛋白復(fù)合物。
1. 裂解細(xì)胞結(jié)構(gòu)
蛋白酶K通過(guò)水解細(xì)胞膜和核膜上的蛋白質(zhì)成分,破壞細(xì)胞完整性。這種作用在動(dòng)物組織樣本處理中尤為關(guān)鍵,例如肝臟、肌肉等富含結(jié)締組織的樣本需使用0.1-0.5mg/ml濃度的蛋白酶K,37℃消化1-3小時(shí)。植物樣本則需配合CTAB法使用,濃度可提升至1mg/ml。
2. 滅活核酸酶
樣本中存在的DNase會(huì)降解目標(biāo)DNA。蛋白酶K在56℃活性最佳的環(huán)境下,能徹底分解這些酶類。實(shí)驗(yàn)室常用方法是將蛋白酶K與樣本在緩沖液中共同孵育,推薦使用pH8.0的Tris-HCl緩沖體系,配合1%SDS使用效果更佳。對(duì)于血液樣本,需延長(zhǎng)消化時(shí)間至4小時(shí)。
3. 解除DNA-蛋白復(fù)合物
染色體DNA常與組蛋白緊密結(jié)合。蛋白酶K能切斷這些連接蛋白,釋放游離DNA。在提取基因組DNA時(shí),建議采用兩步消化法:先用0.2mg/ml蛋白酶K預(yù)處理30分鐘,離心后取上清再加0.5mg/ml濃度繼續(xù)消化。特殊樣本如福爾馬林固定組織,需將消化時(shí)間延長(zhǎng)至24小時(shí)。
實(shí)際應(yīng)用中需注意溫度控制,低于37℃會(huì)顯著降低酶活,高于65℃則導(dǎo)致不可逆失活。對(duì)于不同樣本類型,哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常需要50-100μg/ml濃度,微生物樣本建議200μg/ml,石蠟包埋組織需提高到500μg/ml。消化完成后,通過(guò)苯酚-氯仿抽提或硅膠柱純化可去除殘余蛋白酶K。