研究發(fā)現(xiàn)：不吃醬油和味精，血脂立馬就降低了，是真的嗎？
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MiRNA在細(xì)胞的各種生理活動(dòng)中起著重要的作用。在細(xì)胞周期調(diào)控中，miRNA可以通過(guò)靶向和抑制細(xì)胞周期調(diào)控基因來(lái)抑制細(xì)胞增殖。然而，在多種腫瘤細(xì)胞中，miRNA的水平表現(xiàn)出明顯的下降，這往往導(dǎo)致細(xì)胞周期的過(guò)度激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖。因此，miRNA可能是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。
最近，來(lái)自北京大學(xué)的杜鵬團(tuán)隊(duì)在《細(xì)胞》雜志上發(fā)表了一項(xiàng)重要研究。通過(guò)在腫瘤細(xì)胞中異源表達(dá)來(lái)自植物的RDR1蛋白，成功提高了腫瘤細(xì)胞的全局miRNA水平，顯著修復(fù)了3’端異常截短的miRNA，最終有效抑制了腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期和增殖。
本研究為腫瘤的miRNA靶向治療提供了全新的思路。
RNA干擾（RNAi）是一種由小RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控現(xiàn)象。根據(jù)來(lái)源和功能特點(diǎn)，微小RNA可分為微小RNA（miRNA） RNA（小干擾RNA，siRNA）。其中，miRNA主要由內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的pri-miRNA加工，通過(guò)形成功能性RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）抑制基因表達(dá)。
在細(xì)胞周期調(diào)控中，miRNA可以通過(guò)靶向和抑制相應(yīng)的細(xì)胞周期調(diào)控基因來(lái)抑制細(xì)胞增殖。然而，在多種腫瘤細(xì)胞中，mirna的功能失衡，尤其是miRNA的全局表達(dá)水平明顯下降，直接導(dǎo)致細(xì)胞周期抑制的解除。
與miRNA不同，siRNA主要由雙鏈RNA （dsrna）底物加工而成，也可以通過(guò)形成RISC來(lái)抑制基因表達(dá)。在植物中，dsRNA可以由不同類型的依賴RNA的RNA聚合酶（RDRs）合成。然而，由于進(jìn)化的丟失，包括人類在內(nèi)的具有二級(jí)免疫系統(tǒng)的脊椎動(dòng)物缺乏RDR介導(dǎo)的siRNA產(chǎn)生機(jī)制。
基于這些，研究人員提出了這樣的想法：能否通過(guò)異源表達(dá)植物RDR蛋白來(lái)提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)小RNA的水平，從而增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用，抑制腫瘤增殖？
為了證實(shí)上述猜想，研究人員首先需要構(gòu)建一個(gè)能夠表達(dá)RDR的細(xì)胞系。在這里，研究人員將擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）和水稻（Oryza sativa，Os）的RDR1基因克隆到攜帶共表達(dá)EGFR基因的慢病毒載體中，然后用這些載體感染不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，獲得了13種能夠誘導(dǎo)RDR1表達(dá)的細(xì)胞系，包括7種實(shí)體瘤（肺癌A549、H結(jié)直腸癌CT116、肝癌HepG2、宮頸癌HeLa、肺癌H1299、前列腺癌PC-3、骨肉瘤U-2OS）、3種白血?。毙訲細(xì)胞白血病Jurkat、慢性髓性白血病K562、 急性淋巴細(xì)胞白血病NALM6）和三種非癌細(xì)胞系（小鼠胚胎細(xì)胞NIH/3T3、人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞RPE-1、人正常前列腺基質(zhì)永生化細(xì)胞WPMY-1）以及兩種能穩(wěn)定表達(dá)RDR1的胚胎干細(xì)胞系（小鼠V6.5和人WIBR3）。
通過(guò)使用能夠表達(dá)mcherry-OsRDR1融合蛋白的慢病毒載體，研究人員發(fā)現(xiàn)OsRDR1蛋白明顯定位于細(xì)胞質(zhì)而非細(xì)胞核，這意味著RDR1可能能夠在細(xì)胞質(zhì)中合成dsRNA，并進(jìn)一步被Dicer加工成siRNA。哺乳動(dòng)物的dsRNA在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer切割成siRNA。如果它位于細(xì)胞核中，產(chǎn)生的dsRNA可能不會(huì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核中發(fā)揮作用。最終，研究人員發(fā)現(xiàn)AtRDR1和OsRDR1可以顯著抑制所有10種癌細(xì)胞的增殖，但對(duì)其他5種非癌細(xì)胞系沒(méi)有影響。
RDR1的異源表達(dá)可以顯著抑制癌細(xì)胞的增殖。
為了探索RDR1的具體機(jī)制，研究人員進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)?；蚪M富集分析，GSEA）顯示AtRDR1和OsRDR1抑制所有七種癌細(xì)胞系中的細(xì)胞周期過(guò)程，但不抑制非癌癥對(duì)照細(xì)胞。具體來(lái)說(shuō)，在腫瘤細(xì)胞系中，超過(guò)30個(gè)核心細(xì)胞周期基因被RDR1強(qiáng)烈抑制。研究人員通過(guò)Western blot和Edu/PI染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果，即RDR1的異源表達(dá)可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期。
RDR1的異源表達(dá)能顯著抑制腫瘤細(xì)胞周期。
接下來(lái)，研究人員對(duì)有或沒(méi)有RDR1誘導(dǎo)表達(dá)的腫瘤/非腫瘤細(xì)胞系的小RNA進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，編碼基因、轉(zhuǎn)座子、非編碼RNA或其他基因組區(qū)域發(fā)生了組合
沒(méi)有檢測(cè)到任何來(lái)自dsRNA的siRNA。這一現(xiàn)象說(shuō)明，RDR1并非是通過(guò)重建siRNA通路來(lái)抑制細(xì)胞周期。
而在另一方面，研究人員也驚訝地發(fā)現(xiàn)，表達(dá)RDR1使得腫瘤細(xì)胞中整體miRNA水平明顯提高，且這一過(guò)程并非是由于細(xì)胞周期阻滯導(dǎo)致的?？紤]到在多種類型的腫瘤細(xì)胞中，miRNA的整體水平均表現(xiàn)為下降，研究人員再次提出假設(shè)：RDR1可能是通過(guò)提高整體miRNA的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的。
為了印證這一猜想，研究人員敲低了DROSHA、DGCR8和AGO2等miRNA通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RDR1對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的抑制作用被解除了。另一方面，過(guò)表達(dá)AGO2卻顯著增強(qiáng)了RDR1介導(dǎo)的這種抑制作用。
之后，研究人員還通過(guò)交聯(lián)免疫共沉淀測(cè)序（crosslinking immunoprecipitation sequencing, CLIP-seq）分析發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)表達(dá)RDR1顯著增強(qiáng)了RISC與靶細(xì)胞周期基因的結(jié)合和識(shí)別。這些結(jié)果表明，RDR1對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用確實(shí)是通過(guò)對(duì)miRNA的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。
RDR1通過(guò)提高整體miRNA水平實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的抑制
接下來(lái)，研究人員想要了解RDR1介導(dǎo)的miRNA通路增強(qiáng)的具體機(jī)制。通過(guò)對(duì)來(lái)源于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）的32種人類患者腫瘤樣本、4種非TCGA原發(fā)腫瘤樣本、39個(gè)正常組織樣本以及26個(gè)癌癥細(xì)胞系的大規(guī)模基因組數(shù)據(jù)挖掘，研究人員發(fā)現(xiàn)，在許多主要的腫瘤樣本或癌細(xì)胞系中，大部分miRNA表現(xiàn)為3’末端只有一個(gè)堿基突出，而正常miRNA3’末端應(yīng)該有2個(gè)堿基突出。
因此，研究人員猜測(cè)，這樣的3’末端異常截短的miRNA可能并不能被AGO2蛋白正常識(shí)別。隨后的體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)也確實(shí)證明了這一點(diǎn)，即AGO2對(duì)正常的3’末端有兩個(gè)堿基突出的miRNA的親和力明顯高于異常截短的miRNA。
腫瘤細(xì)胞中有大量3’末端截短的miRNA
之后，研究人員進(jìn)一步證實(shí)，RDR1會(huì)優(yōu)先識(shí)別3’端發(fā)生截短的miRNA，并為其添加單核苷酸（A、T、C或G）。而小RNA northern blot分析結(jié)果也顯示誘導(dǎo)表達(dá)RDR1后，腫瘤細(xì)胞中3’末端異常截短的miRNA含量顯著減少而長(zhǎng)度正常的miRNA則顯著增加。
異源表達(dá)RDR1可修復(fù)3’末端截短的異常miRNA
最后，為了探究RDR1異源表達(dá)的實(shí)際應(yīng)用前景，研究人員進(jìn)行了多方面的綜合驗(yàn)證。小鼠異種移植實(shí)驗(yàn)表明，RDR1可顯著抑制實(shí)體瘤（肺癌A549和H1299、前列腺癌PC-3）（如下圖A-C所示）和淋巴癌（Jurkat、K562、NALM6）的發(fā)展。而使用納米顆粒和AAV傳遞系統(tǒng)則分別能有效實(shí)現(xiàn)RDR1蛋白的體外和體內(nèi)傳遞。這些結(jié)果都說(shuō)明，基于RDR1的miRNA靶向療法或許是一種有潛力的腫瘤治療手段。
基于RDR1的miRNA靶向療法可能是一種有潛力的腫瘤治療手段
近些年來(lái)，已經(jīng)有越來(lái)越多的miRNA被鑒定為腫瘤促進(jìn)/抑制因子，作為一種有效的分子靶點(diǎn)，目前針對(duì)miRNA的腫瘤治療方案主要有兩種，一種是通過(guò)miRNA類似物補(bǔ)償腫瘤抑制miRNA的作用，或者通過(guò)人工合成反義寡核苷酸，阻斷腫瘤促進(jìn)miRNA的作用。然而，在臨床實(shí)驗(yàn)中，這些方法都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的毒理學(xué)效應(yīng)，這為其進(jìn)一步發(fā)展及應(yīng)用提出了挑戰(zhàn)[2]。
與以上思路不同，此研究另辟蹊徑，通過(guò)異源表達(dá)植物RDR1基因，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤中低miRNA水平的補(bǔ)償及異常miRNA的修復(fù)，最終使腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期受到抑制?？偟膩?lái)說(shuō)，研究為靶向miRNA的腫瘤治療提供了一種新思路，未來(lái)期待這一療法的進(jìn)一步發(fā)展能為廣大癌癥患者帶來(lái)更多的驚喜。